Fluorescences mikroskops — darbības princips, uzbūve un pielietojumi

Fluorescences mikroskops — darbības princips, uzbūve un pielietojumi: skaidro tehnoloģiju, optiku un praktiskos pielietojumus medicīnā, bioloģijā un rūpniecībā.

Fluorescences mikroskops ir optiskais mikroskops, kas izmanto fluorescenci un fosforescenci, lai pētītu organiskas vai neorganiskas vielas. "Fluorescences mikroskops" ir jebkurš mikroskops, kas attēla iegūšanai izmanto fluorescenci. Tas attiecas gan uz vienkāršāku, gan sarežģītāku konstrukciju.

Lielākajai daļai fluorescences mikroskopu, īpaši tiem, ko izmanto dzīvības zinātnēs, ir diagrammā parādītā epifluorescences konstrukcija. Gaisma ar ierosmes viļņa garumu izstaro paraugu caur objektīvu. Parauga izstarotā fluorescence tiek fokusēta uz detektoru. Dihroiskais staru sadalītājs darbojas kā filtrs, kas nosaka viļņa garumu, caurlaižot fluorescējošo gaismu uz okulāru vai detektoru, bet atstarojot visu atlikušo uzbudinājuma gaismu atpakaļ uz avotu.

Darba princips — īsi un saprotami

Fluorescences mikroskopa darbība balstās uz šādiem soļiem:

• Izgaismošana: mikroskopa gaismas avots (piem., kvēlspuldze, dzīvsudraba/xenona lampa, LED vai lāzers) ģenerē gaismu ar zināmu viļņa garumu, kas spēj uzbudināt fluoroforus.
• Uzbudinājums: gaisma ar uzbudinājuma (eksitācijas) viļņa garumu sasniedz paraugu, kura molekulas absorbē enerģiju un pāriet augstākā enerģijas līmenī.
• Emisija: uzbudinātās molekulas ļoti īsi pēc tam izstaro fotonus ar garāku viļņa garumu (fluorescenci), ko fiksē optiskā iekārta.
• Filtrēšana un detektēšana: optiskie filtri un dihokrātiskie spoguļi atdala uzbudinājuma gaismu no emisijas, ļaujot tikai fluorescējošajai gaismai nonākt pie okulāra, kameras vai detektora.

Uzbūve un galvenās sastāvdaļas

• Gaismas avots: tradicionāli — dzīvsudraba vai xenona lampa; mūsdienās bieži izmanto LED vai lāzerus. Lāzeri nodrošina koherentu un intensīvu gaismu, svarīgi konfokālajā un TIRF mikroskopijā.
• Eksitācijas un emisijas filtri: izvēlas atbilstošus viļņa garumus, lai nodrošinātu, ka tikai uzbudinājuma vai emisijas gaisma tiek cauri.
• Dihroiskais spogulis (dichroic beam splitter): atstaro uzbudinājuma gaismu uz parauga un caurlaiž emisijas gaismu uz detektoru.
• Objektīvi: fluorescences objektīvi bieži ir ar augstu numurisko apertūru (NA) un speciālām pārklājuma kārtām, lai samazinātu autofluorescenci un palielinātu signālu.
• Detektori: okulārs (vizuālam novērojumam) vai kameras — CCD/CMOS; konfokālajos mikroskopos izmanto fotomultiplikatorus (PMT) vai īpašus detektorus.
• Konfokālā galviņa (ja pieejama): ļauj iegūt optiski šķērsgriezumus, samazina izkliedēto gaismu un uzlabo kontrastu un telpisko izšķirtspēju.

Galvenie tipu un tehnoloģiju piemēri

• Widefield/epifluorescence: klasiska konstrukcija, piemērota ātrai un vienkāršai vizualizācijai.
• Konfokālais fluorescences mikroskops: izmanto punktu apgaismojumu un reālu laika skenēšanu vai spraugu skenēšanu, lai iegūtu optiski sekcionētu attēlu ar labāku izšķirtspēju.
• TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence): ļoti jutīga metode, kas attēlo tikai stingri pie membrānas esošos fluoroforus (dažu 100 nm dziļumā), piemērota šūnu membrānas pētījumiem.
• Multiphotonu mikroskopija: izmanto divu vai vairāku fotonu eksitāciju dziļai audu attēlošanai ar samazinātu fototoksicitāti.

Paraugu sagatavošana un marķēšana

Paraugam jābūt marķētam ar piemērotiem fluoroforiem (krāsvielām vai fluorescējošiem proteīniem — piemēram, GFP), kas atbilst mikroskopa eksitācijas/emisijas spektriem. Bieži lietotas metodes:

• Imūnfluorescense — antivielas, atzīmētas ar fluoroforiem.
• Tieša marķēšana — fluorofori, kas piesaistīti mērķmolekulām.
• Ģenētiski kodēti fluorescējoši proteīni (piem., GFP un atvasinājumi) — dzīvu šūnu pētniecībā.

Paraugam svarīgi: samazināt autofluorescenci, immobilizēt kustīgus komponentus, izvēlēties atbilstošus montēšanas līdzekļus un antifade reaģentus, lai samazinātu fotoblekēšanos.

Pielietojumi

• Šūnu un molekulāro procesu vizualizācija (lokalizācija, transports, interakcijas).
• Imūnhistohīmija un patoloģija — specifisku markeru noteikšana audos.
• Dzīvu šūnu imidžēšana un laika gaitas eksperimenti.
• Materialzinātne — nanopartikulu, polimeru vai minerālu fluorescences īpašību pētīšana.
• Forenzika un vides monitorings — specifisku vielu atklāšana.

Ieguvumi un ierobežojumi

• Ieguvumi: liels jutīgums, iespēja marķēt specifiskas molekulas, krāsu spektrālā analīze un dzīvo paraugu attēlošana.
• Ierobežojumi: fotoblekēšanās (fluoroforu iznīkšana apgaismojuma ietekmē), fototoksicitāte dzīviem paraugiem, autofluorescence, spektrālais pārklājums starp fluoroforiem un ierobežota dziļuma izšķirtspēja widefield mikroskopiem.

Drošība un uzturēšana

• Strādājot ar UV un intensīvu zilo gaismu vai lāzeriem, jālieto acu aizsardzība un jāievēro lāzeru drošības noteikumi.
• Regulāra filtru, objektīvu un avotu tīrīšana uzlabo attēla kvalitāti. Avotu kalpošanas laiku un lāzeru jaudu jāuzrauga.
• Izmantot antifade reaģentus un optimizēt apgaismojuma intensitāti, lai samazinātu fotoblekēšanos un saglabātu parauga dzīvotspēju.

Kopsavilkums

Fluorescences mikroskops ir jaudīgs instruments gan bioloģijā, gan materiālzinātnē, kas ļauj vizualizēt ļoti specifiskus mērķus ar augstu jutīgumu. Pareiza optikas izvēle, piemērota paraugu sagatavošana un rūpīga darba prakse ļauj gūt skaidrus un reproducējamus rezultātus, vienlaikus mazinot fotoblekēšanos un citus traucējumus.

Jautājumi un atbildes

J: Kas ir fluorescences mikroskops?

J: Ko nozīmē termins "fluorescences mikroskops"?

J: Kāda ir vairuma dzīvības zinātnēs izmantoto fluorescences mikroskopu konstrukcija?

J: Kā fluorescences mikroskops izgaismo paraugu?

J: Kā fluorescences mikroskops nosaka parauga izstaroto fluorescenci?

J: Kāda ir dihroiskā staru sadalītāja funkcija fluorescences mikroskopā?

J: Kāda ir atšķirība starp fluorescenci un fosforescenci?

Meklēt pēc burta