Selekcionējamie marķieri (ģenētika): definīcija un piemēri
Selekcionējams marķieris ir gēns, kas kopā ar gēna ieliktni tiek ieviests šūnā, lai ļautu noteikt, kuras šūnas veiksmīgi uzņēmušas šo ieviesto DNS. Marķieris nodrošina konkrētu, viegli novērojamu vai konstatējamu pazīmi — piemēram, augšanu speciālā barotnē, rezistenci pret antibakteriālu vielu vai fluorescenci — kas ļauj pētniekam atšķirt transformētās šūnas no netransformētajām.
Šie marķieri tiek plaši izmantoti darbā ar baktērijām, sēnēm un šūnu kultūrām (piem., eikariotu vai mammas šūnām). Transfekcijas un citas metodes, kas paredz svešas DNS ievadīšanu šūnā, prasa drošu veidu, kā noteikt, vai iejaukšanās ir izdevusies — tieši to nodrošina selekcionējamie marķieri. Tos izmanto arī gēnu mērķēšanai, gēnu izslēgšanai (knockout) un stabilu transgēno līniju izveidei.
Galvenie marķieru tipi un piemēri
- Antibiotiku rezistences gēni — visizplatītākie baktēriju un kultūru selekcijai. Piemēri: ampR (ampicilīna rezistence), kanR/neo (kanamicīna/neomicīna/G418 rezistence), tetR (tetraciklīna), cat (hloramfenikola), hygR (higromicīna), puroR (puromicīna). Šīs šūnas tiek audzētas uz barotnēm ar attiecīgo antibiotiku; antibiotika nogalinās ne-rezistentās šūnas.
- Auxotrofiskie marķieri — izmanto raugiem un mikroorganismiem, kuriem trūkst spējas sintezēt kādu nepieciešamu vielu. Piemēri: URA3, HIS3, LEU2. Transformanti aug uz barotnēm bez attiecīgās vielas.
- Fluorescējošie un gaismas reaģējošie reportieri — screenable marķieri, kas ļauj tieši vizuāli atpazīt transformētas šūnas bez nāvējošas selekcijas. Piemēri: GFP, RFP, luciferāze. Labi piemēroti šūnu lokalizācijas, ekspresijas un dinamisku procesu novērošanai.
- Enzimātiskie reportieri — β‑galaktosidāzes (lacZ) vai β‑glikuronidāzes (GUS) gēni, kas dod redzamu krāsu reakciju vai citu detektējamu signālu.
- Kontrselektējamie (negative selection) marķieri — ļauj atlasīt šūnas, kas ir zaudējušas marķieri vai gēnu. Piemēri: sacB (sensitivitāte pret saharozes klātbūtni baktērijās), URA3 (yeast) var darboties gan kā pozitīvs, gan negatīvs marķieris atkarībā no apstākļiem.
- Specifiski augu un dzīvnieku marķieri — piemēram, bar (glifosāta/glufosināta rezistence) augu selekcijā; neo/hyg/puro populāri mammas šūnu selekcijā.
Selekcionējams vs. ekranējams marķieris
Atšķirība ir praktiskā pieeja: selekcionējams marķieris ļauj tieši iznīcināt netransformētās šūnas vai citādi bloķēt to augšanu, t.i., nodrošina strauju un drošu izvēli. Ekranējams marķieris (piem., fluorescences proteins vai krāsojošs enzīms) ļauj identificēt transformantus, bet prasa manuālu vai instrumentālu pārbaudi un parasti neiznīcina netransformētās šūnas.
Praktiski apsvērumi un riski
- Drošība un vides ietekme: antibiotiku rezistences gēnu izmantošana prasa piesardzību, lai nepalaistu rezistences elementus brīvā vidē; laboratorijas prakses un regulas jāievēro.
- Selekcijas stingrība un viltus pozitīvi: nepietiekama selekcijas spiediena gadījumā var augt netransformētas šūnas; dažkārt notiek integrācijas vai ekspresijas zudums, kas prasa papildu verifikāciju (PCR, sekvencēšana, fenotipa testi).
- Marķiera ekspresijas līmenis un promoters: panākumiem ir svarīgi izvēlēties piemērotu promoteru un vektora dizainu, lai marķieris tiktu pietiekami izteikts selekcijai.
- Marķiera noņemšana: dažkārt pēc mērķa ģenētiskā modifikācijas pabeigšanas ir vēlme marķieri izņemt (piem., terapijas vai komerciālu produktu gadījumā). Izmanto sistēmas kā Cre‑lox vai FLP‑FRT, vai marker‑free stratēģijas ar CRISPR.
Tipiskas lietošanas jomas
- Rekombinantās DNS klonēšana un vektoru atpazīšana.
- Stabilu transgēnu šūnu līniju izveide un uzturēšana.
- Gēnu knockout vai mērķēšanas eksperimenti.
- Fenotipu ekrēningi un reportieru ekspresijas pētījumi.
Izvēloties selekcionējamu marķieri, jāņem vērā organisms, eksperimenta mērķis, drošības prasības un iespējamās ilgtermiņa seku novēršanas stratēģijas. Pareiza marķiera un selekcijas protokola izvēle būtiski ietekmē eksperimenta panākumus un reproducējamību.
Atlasāmo marķieru piemēri ir šādi:
- AmpiCilīna rezistence (ampR)
- Kanamicīna/Neomicīna/G418 rezistence (kanR/neo)
- Tetraciklīna rezistence (tetR)
- Hloramfenikola acetiltransferāze (cat)
- Higromicīna rezistence (hygR)
- Puromicīna rezistence (puroR)
- URA3, HIS3, LEU2 (auxotrofiskie marķieri raugiem)
- GFP, RFP, luciferāze (fluorescējošie un luminescējošie reportieri)
- lacZ (β‑galaktosidāze), GUS (β‑glikuronidāze)
- bar (augu herbicīdu rezistence)
- sacB (kontrselektējamais marķieris)
Jautājumi un atbildes
J: Kas ir atlasāms marķieris?
A: Selekcionējams marķieris ir reportiera gēns, kas ieviests šūnā kopā ar gēna ieliktni, kas ļauj eksperimentētājam noteikt, vai šūnā ir pareizais gēns, jo marķieris ir redzams vai konstatējams.
J: Kāda veida šūnām visbiežāk izmanto selekcionējamo marķieri?
A: Selekcijas marķieri visbiežāk tiek izmantoti baktērijām vai kultūras šūnām.
J: Kāds ir selektīvo marķieru mērķis?
A: Selekcijas marķieru mērķis ir parādīt, cik veiksmīga ir transfekcija vai cita procedūra, kas paredzēta svešas DNS ievadīšanai šūnā.
J: Kādā tehnikā izmanto selekcionējamos marķierus?
A: Selekcionējamos marķierus izmanto gēnu mērķēšanas un gēnu izslēgšanas tehnikā.
J: Kādi ir selekcionējamo marķieru piemēri?
A: Selekcionējamo marķieru piemēri ir rezistences pret antibiotikām gēni.
J: Kā antibiotiku rezistences gēns darbojas kā selekcionējams marķieris?
A: Baktērijas, kas ir pakļautas procedūrai, lai ieviestu svešu DNS, tiek audzētas uz barotnes, kas satur antibiotiku. Antibiotika iznīcina šūnas, kurām nav rezistenta marķiera. Tās baktēriju kolonijas, kas var augt, ir veiksmīgi uzņēmušas un izteikušas ieviesto ģenētisko materiālu.
K: Kas ir alternatīva selekcionējamam marķierim?
A: Alternatīva selekcionējamam marķierim ir selekcionējams marķieris, kas ļauj pētniekam atšķirt vēlamās un nevēlamās šūnas.
