Transfekcija — DNS un RNS ievadīšana šūnās: definīcija un sekas
Uzzini, kas ir transfekcija — DNS/RNS ievadīšana šūnās, metodes, ģenētiskās sekas, morfoloģiskas izmaiņas un gēnu terapijas riski. Praktiskas implikācijas un drošība.
Transfekcija ir DNS vai RNS apzināta ievadīšana šūnās. Termins radies no transformācija un infekcija un tiek lietots dažādos eksperimentālos un klīniskos kontekstos. Zemāk ir galvenie transfekcijas veidi un to galvenās lietojuma jomas:
- Baktēriju šūnu transformācija ar vīrusu nukleīnskābēm
- Dzīvnieku šūnu transformācija audu kultūrā ar attīrītu DNS. DNS tiek pievienota šūnu genomam.
- Šūnu vai embriju transformācija ar vienšūnu vai divšūnu RNS. Tas izraisa noteiktu olbaltumvielu veidošanos vai noteiktu gēnu apklusināšanu.
- Gēnu terapija, izmantojot modificētu vīrusu kā vektoru.
Metodes un pieejas
Transfekciju var veikt, izmantojot dažādas ķīmiskas, fiziskas vai vīrusu bāzētas metodes. Izplatītākās pieejas ietver:
- Ķīmiskas metodes — lipofekcija (liposomu vai nanodaļiņu veidā), kalcija fosfāta metode u. c. Šīs metodes ir ērti lietojamas audu kultūrām un bieži izvēlētas, ja nepieciešama zema šūnu bojājuma līmeņa transfekcija.
- Fiziskas metodes — elektroporācija (elektroporators), mikroinjekcija, vakumsistēmas vai lipētiskās sistēmas. Tās ļauj iekļūt lielākām molekulām un strādā ar sarežģītākiem šūnu tipiem, bet var palielināt šūnu bojājumus.
- Vīrusu vektori — modifikēti vīrusi (piem., lentivīrusi, adenovīrusi, AAV) nodrošina augstu transfekcijas efektivitāti un ilgstošu ekspresiju; tomēr pastāv risks saistībā ar integrāciju genoma vai imūnreakcijām.
Īslaicīga ("transient") pret pastāvīgu ("stable") transfekciju
RNS transfekcija (piem., mRNA, siRNA) parasti rada īslaicīgas izmaiņas — molekulas netiek integrētas genomā un to efekts izzūd, kad molekulas tiek noārdītas vai zaudē aktivitāti. Savukārt DNS transfekcija ar plazmīdiem var būt īslaicīga (ekspresija bez integrācijas) vai pārejoša, ja plazmīds netiek selekcionēts. Ja mērķis ir izveidot pastāvīgu šūnu līniju, parasti izmanto selekcijas markerus (antibiotikas rezistence) vai vīrusu vektorus, kas var integrēties genoma — tas ļauj ģenētiski stabilu ekspresiju.
Sekas un riski
Transfekcijas rezultātā mērķa šūnās var rasties neparedzētas morfoloģijas izmaiņas, šūnu stress vai pat šūnu nāve. Turklāt transfekcija var izraisīt šādas sekas:
- Citolītiskums un samazināta dzīšanas spēja — īpaši pie augstākām devas vai agresīvām metodēm (elektroporācija).
- Imūnreakcijas — RNS (īpaši nepietiekami modificēta) var aktivizēt šūnu iekšējo antivīrusu atbildi (piem., interferonu ceļus).
- Off-target efekti — siRNA/sgRNA var negaidīti ietekmēt citus gēnus; vīrusu integrācija var izraisīt insercijas mutagēzi, kas maina geno un novērš normālu gēnu darbību.
- Fenotipiskas izmaiņas — šūnu forma, proliferācija un diferenciācija var tikt ietekmēta, kas var apgrūtināt eksperimenta interpretāciju.
Transfekcija ar RNS molekulām rada izmaiņas, kuras parasti nevar pastāvīgi pārnest uz šūnu līniju, kamēr DNS, kas integrējas genomā, var radīt ilgstošas vai mūžīgas izmaiņas šūnas genotipā un fenotipā.
Labas prakses ieteikumi
- Optimizējiet transfekcijas nosacījumus katram šūnu tipam (reagenss, daļa DNS/RNS, laiks pēc transfekcijas).
- Iekļaujiet kontroles — negatīvas (tukšs vektors) un pozitīvas (pazīstams reporters), kā arī šūnu dzīvotspējas testus.
- Izmantojiet attiecīgus drošības pasākumus, īpaši strādājot ar vīrusu vektoriem un cilvēka izcelsmes materiāliem.
- Ja nepieciešams pastāvīgs mainījums, apzinieties insercijas riskus un izmantojiet rūpīgu ģenētisko raksturošanu (piem., integrācijas skaitīšana, whole-genome sequencing pēc iespējas klīniskos pētījumos).
Pielietojumi
Transfekcija ir plaši izmantota pētījumos un medicīnā, tostarp:
- gēnu ekspresijas un funkcijas pētījumi,
- proteīnu ražošana audu kultūrās,
- gēnu klusēšana (RNAi),
- ģenētiskā rediģēšana (piem., CRISPR/Cas sistēmu ievadīšana),
- gēnu terapijas attīstība un vakcīnu izstrāde (izmantojot gan DNA, gan mRNA pieejas).
Drošība un ētika
Gēnu pārnešana uz cilvēku vai primātu šūnām un klīniskā gēnu terapija prasa stingru regulatīvu uzraudzību, ētisku izvērtējumu un drošības testus. Laboratorijās jāievēro attiecīgie biosdrošības līmeņi un jānodrošina piemērota apmācība darbiniekiem.
Kopumā transfekcija ir jaudīgs rīks molekulārajā bioloģijā un medicīnā, taču tai jāpieiet apdomīgi — izvēloties metodi, optimizējot nosacījumus un novērtējot iespējamos riskus un blaknes efektus.
DNS konstrukcijas
DNS konstrukts ir mākslīgi izveidots nukleīnskābes gabaliņš, kas tiks "pārstādīts" mērķa audos vai šūnā. Tas var ietvert DNS ieliktni, kas satur gēna sekvenci, kura kodē interesējošo olbaltumvielu.
DNS ieliktnis ir molekulārās bioloģijas vektora sirds. Tas ir vispārīgs termins, ar ko apzīmē līdzekli, ko izmanto sveša ģenētiskā materiāla pārnesei citā šūnā. Dzīvnieku šūnu transfekcija parasti ietver īslaicīgu poru (caurumu) atvēršanu šūnu membrānā, lai šūnas varētu uzņemt vektoru.
Jautājumi un atbildes
J: Kas ir transfekcija?
A: Transfekcija ir process, kurā šūnās apzināti ievieš DNS vai RNS.
J: Kā veidojas termins "transfekcija"?
A: Termins "transfekcija" ir izveidots no vārdiem "transformācija" un "infekcija".
J: Kādi ir dažādi transfekcijas veidi?
A: Dažādi transfekcijas veidi ir šādi: baktēriju šūnu transformācija ar vīrusu nukleīnskābēm, dzīvnieku šūnu transformācija audu kultūrā ar attīrītu DNS, šūnu vai embriju transformācija ar viendzīslu vai divdzīslu RNS un gēnu terapija, izmantojot modificētu vīrusu kā vektoru.
J: Kas notiek, kad transfekcijas laikā šūnu genomam tiek pievienota DNS?
A: Kad šūnu genomam transfekcijas laikā pievieno DNS, tā var izraisīt noteiktu olbaltumvielu veidošanos vai noteiktu gēnu apklusināšanu.
J: Vai izmaiņas, kas radušās transfekcijas ar RNS molekulām rezultātā, var tikt pastāvīgi pārnestas pa šūnu līniju?
A: Nē, izmaiņas, kas radušās, transfekcijas procesā izmantojot RNS molekulas, nevar tikt pastāvīgi pārnestas uz šūnu līniju.
J: Ko var izraisīt transfekcija?
A: Transfekcijas rezultātā mērķa šūnās var rasties neparedzētas morfoloģijas un anomālijas.
J: Kāds ir gēnu terapijas mērķis, izmantojot modificētu vīrusu kā vektoru?
A: Gēnu terapijas mērķis, izmantojot modificētu vīrusu kā vektoru, ir ieviest jaunus, funkcionālus gēnus indivīda ar ģenētisku slimību genomā, cerot izlabot vai ārstēt slimību.
Meklēt