Transformācija: baktēriju DNS uzņemšana un transfekcija

Transformācija un transfekcija: padziļināts ceļvedis par baktēriju DNS uzņemšanu, kompetenci, mākslīgajām metodēm un praktiskiem ģenētiskās inženierijas pielietojumiem.

Molekulārajā bioloģijā transformācija ir šūnas ģenētiska pārveidošana, tieši uzņemot un izpaužot DNS no tās apkārtnes. Šis process var mainīt šūnas īpašības, ja ievestā DNS satur aktīvus gēnus vai regulatorus, kas tiek izteikti jaunajā saimniekā.

Dažām baktēriju sugām transformācija notiek dabiski, un to var veikt arī mākslīgi. Baktērijas, kuras var transformēties dabiski vai mākslīgi, sauc par kompetentām. Dabiska kompetence nozīmē, ka konkrēta suga īsā laika posmā izsaka īpašas olbaltumvielas un receptorus, kas atpazīst un ievada brīvo ārējo DNS; mākslīgā kompetence tiek inducēta laboratorijā ar fizikālām vai ķīmiskām metodēm.

Procesa galvenie posmi un molekulārais mehānisms

Transformācijas laikā parasti notiek šādi soļi:

• DNS piekļūšana un saistīšanās ar šūnu virsmu;
• DNS ievade šūnas iekšienē (bieži vien tiek ievests vienpavedienu fragments);
• iekššūnas apstrāde — ievestais fragments var tikt aizsargāts, degradēts vai apvienots ar saimniekorganisma hromosomu;
• integrācija un izpausme — ja DNS tiek integrēta vai saglabāta kā plazmīds, jauni gēni var tikt izteikti un dot fenotipisku izmaiņu.

Daudziem bakteriju procesiem nepieciešama homologā rekombinācija, kurā iesaistās proteīni, piemēram, RecA, lai savienotu ievestos fragmentus ar līdzīgām ķēdēm saimnieka genomā.

Dabiska kompetence un tās piemēri

Dažas baktēriju sugas attīsta dabiska kompetenci noteiktos apstākļos (piemēram, barības trūkuma, blīvuma vai stresa laikā). Zināmi piemēri ir Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Neisseria un Haemophilus influenzae. Šajās sugās kompetence bieži tiek regulēta ar īpašiem gēniem (piem., com sistēmas), kas kontrolē receptoru un nukleāzes izteiksi uzmembrānas transportam.

Mākslīgās transformācijas metodes laboratorijā

Bakteriālajā molekulārajā bioloģijā galvenās mākslīgās metodes ir:

• Ķīmiski inducēta kompetence (parasti CaCl2): šūnas apstrādā ar jonišķiem sāļiem, kas padara membrānu caurlaidīgāku un ļauj plazmīdu DNS iekļūt; pēc tam bieži izmanto siltuma šoku.
• Elektroporācija: īsas, spēcīgas elektriskās impulses brāzmas veicina membrānas poru atvēršanos un DNS pāreju iekšā; piemērota gan gramnegatīvām, gan grampozitīvām baktērijām un citām šūnām.
• Protoplastu trasformācija: šūnas, no kurām noņemta cietā šūnapvalka, var vieglāk pieņemt DNS un vēlāk atjaunot sienu.

Transformācijas efektivitāti raksturo kā transformantu skaitu uz mikrogramu ievadītās DNS; tas atšķiras pēc metodes, šūnu stāvokļa un izmantotās DNS (linieārs fragments vs. cirkulārs plazmīds).

Atšķirība starp transformāciju un transfekciju

Transformācija parasti tiek lietota, runājot par prokariotu, jo īpaši baktēriju, DNS uzņemšanu. Svešas DNS ievietošanu eikarijotu šūnās parasti sauc par "transfekciju". Eukariontu transfekcijas metodes ietver:

• lipofekciju (liposomu vai lipidmiskarrieru izmantošana);
• kalcija fosfāta metodiku;
• elektroporāciju;
• mikroinjekciju;
• vīrusu vektoru lietošanu (lentivīrusi, adenovīrusi u.c.).

Terminoloģiski dažkārt "transformācija" tiek lietota arī eukariontos (piem., sēnēs), taču laboratoriskā prakse nodala terminus, lai saglabātu precizitāti.

Lietojumi un nozīme

Transformācija ir fundamentāla metode molekulārajā bioloģijā un biotehnoloģijā. Galvenie pielietojumi:

• klonēšana un rekombinantās DNS izveide (plazmīdu ievietošana, vektoru sistēmas);
• proteīnu ekspresija un bioproduktu ražošana;
• ģenētiskā inženierija, to skaitā CRISPR/Cas sistēmu ieviešana un genoķermeņu modifikācijas;
• genealoga pētījumi un genotipu noteikšana;
• izglītības eksperimenti un diagnostikas testu izstrāde.

Vēsturiskie aspekti

Transformācijas fenomens bija nozīmīgs pavērsiens mikrobioloģijā: 1928. gadā Frederick Griffith demonstrēja, ka nedzīvā materiālā ir "transformējošs princips", bet 1944. gadā Oswald Avery, Colin MacLeod un Maclyn McCarty identificēja šo principu kā DNS, pierādot DNS lomu kā ģenētiskā materiāla nesēju.

Drošība un ētika

Laboratorijā veiktas transformācijas bieži izmanto selekcijas marķierus (piem., antibiotiku rezistences gēnus) — to izmantošana prasa atbilstošu bioloģiskās drošības praksu, lai izvairītos no rezistences gēnu izplatīšanās dabā. Darbs ar patogēniem vai ģenētiski modificētiem organismiem jāveic atbilstošā kontroles līmenī un ievērojot ētikas un normatīvās prasības.

Transformācija ir spēcīgs rīks, kas, pareizi un atbildīgi lietota, ļauj pētīt ģenētiku, radīt jaunas biotehnoloģiskās lietojumprogrammas un attīstīt medicīnas risinājumus.

Jautājumi un atbildes

J: Kas ir transformācija molekulārajā bioloģijā?

J: Kurā baktēriju sugā transformācija notiek dabiski?

J: Kā apzīmē baktērijas, kas spēj transformēties?

J: Kādi ir vēl divi citi procesi, ar kuru palīdzību bez transformācijas baktēriju šūnās var ienest ārēju ģenētisko materiālu?

J: Vai transformāciju var veikt mākslīgi?

J: Kāda ir transfekcijas definīcija?

J: Ar ko transfekcija atšķiras no transformācijas?

Meklēt pēc burta