Virzītā evolūcija
Virzītā evolūcija (DE) ir metode, ko izmanto, lai iegūtu fermentus rūpnieciskiem vai medicīniskiem mērķiem.
Šī metode ir proteīnu inženierija, kas imitē dabisko atlasi.
Pamatideja ir gēnu pakļaut atkārtotām mutāciju kārtām, lai izveidotu variantu bibliotēku. Selekcijas rezultātā tiek izdalīti gēni ar vēlamo funkciju. Tie ir paraugs nākamajai kārtai.
To var veikt in vivo (dzīvās baktēriju vai rauga šūnās) vai in vitro (brīvi šķīdumā vai mikrodaļiņās).
Testējot vairāk mutantu, palielinās iespēja atrast tādu, kam piemīt vēlamās īpašības.
In vivo evolūcijas laikā katra šūna (parasti baktērijas vai raugs) tiek transformēta ar plazmīdu, kas satur dažādu variantu bibliotēkas locekli. Starp šūnām atšķiras tikai interesējošais gēns, bet visi pārējie gēni ir nemainīgi.
Šūnas ekspresē proteīnu vai nu citoplazmā, vai uz virsmas, kur var pārbaudīt tā funkciju. Šāda formāta priekšrocība ir tā, ka tiek atlasītas īpašības šūnu vidē, kas ir noderīgi, ja attīstīto proteīnu vai RNS paredzēts izmantot dzīvos organismos.
Ja DE tiek veikta bez šūnām, tiek izmantota in vitro transkripcijas translācija, lai radītu proteīnus vai RNS bez šķīduma vai mākslīgās mikrokropelēs. Šādas metodes priekšrocība ir tā, ka ir iespējami dažādi apstākļi (piemēram, temperatūra, šķīdinātāji). Tā var izteikt olbaltumvielas, kas šūnām būtu toksiskas. Turklāt in vitro evolūcijas eksperimentos var izveidot daudz lielākas bibliotēkas (līdz 1015), jo bibliotēkas DNS nav jāievada šūnās. Tas bieži vien ierobežo to, ko var izdarīt.
Virzītas evolūcijas piemērs salīdzinājumā ar dabisko evolūciju. Iekšējais cikls parāda trīs virzītās evolūcijas cikla posmus, iekavās norādot imitēto dabisko procesu. Ārējā aplī parādīti tipiska eksperimenta posmi. Sarkanie simboli norāda funkcionālos variantus, bālie simboli norāda variantus ar samazinātu funkciju.
Iedzimtības nodrošināšana
Kad ir izolēti funkcionāli proteīni, ir nepieciešams, lai arī to gēni būtu izolēti, tāpēc ir nepieciešama genotipa-fenotipa saikne.
Tas var būt kovalents, kad mRNS gēns ir saistīts ar proteīnu tulkošanas beigās ar puromicīnu.
Alternatīvi proteīnu un tā gēnu var glabāt kopā vai emulsijas pilienos. Izolētās gēnu sekvences pēc tam pavairo ar PCR vai ar transformētām saimnieka baktērijām. Kā veidni nākamajam mutagenēzes posmam var izmantot vai nu vienu labāko sekvenci, vai sekvenču kopumu. Atkārtoti diversifikācijas-selekcijas-amplifikācijas cikli rada fermentu variācijas, kas pielāgotas selekcijas procesam.
Izteikto olbaltumvielu var kovalentizēt ar tās gēnu (kā mRNS) (pa kreisi) vai ievietot vienā nodalījumā ar to (pa labi). Jebkurā gadījumā gēnu, kas kodē olbaltumvielu, izolē.
Piešķirtā balva
ASV inženieris Frānsiss Arnolds ir ieguvis Tūkstošgades tehnoloģiju balvu par novatorismu virzītas evolūcijas jomā.
Jautājumi un atbildes
J: Kas ir virzītā attīstība?
A: Virzītā evolūcija (DE) ir metode, ko izmanto, lai ražotu fermentus rūpnieciskiem vai medicīniskiem mērķiem. Tas ir proteīnu inženierijas veids, kas imitē dabisko atlasi.
J: Kā darbojas virzītā evolūcija?
A.: Virzītā evolūcija darbojas, gēnu pakļaujot atkārtotām mutāciju kārtām, radot variantu bibliotēku. Selekcija pēc tam izolē gēnus ar vēlamo funkciju, kurus izmanto kā veidnes nākamajā kārtā.
J: Kur var veikt virzītu evolūciju?
A: Virzītu evolūciju var veikt in vivo (dzīvās baktēriju vai rauga šūnās) vai in vitro (brīvi šķīdumā vai mikrodaļiņās).
J: Kādas ir priekšrocības, veicot virzītu evolūciju in vivo?
A. Virzītas evolūcijas in vivo priekšrocība ir tā, ka atlasa īpašības šūnu vidē, kas ir noderīgi, ja attīstīto proteīnu vai RNS paredzēts izmantot dzīvos organismos.
J: Kādas ir priekšrocības, veicot virzītu evolūciju in vitro?
A: Virzītas evolūcijas in vitro priekšrocība ir tā, ka ir iespējami dažādi apstākļi (piemēram, temperatūra, šķīdinātāji), un tā var izteikt olbaltumvielas, kas šūnām būtu toksiskas. Turklāt tā var izveidot daudz lielākas bibliotēkas, jo DNS nav jāievada šūnās.
J: Kas ierobežo to, ko var darīt in vitro eksperimenta laikā?
A: In vitro eksperimenta laikā veicamo darbību lieluma ierobežojumu bieži nosaka tas, cik daudz DNS ir jāievada šūnās.
