Grama krāsošana: metode, princips un baktēriju klasifikācija

Grama krāsošana (vai Grama metode) ir klasiska laboratorijas krāsošanas tehnika, ar kuru baktērijas iedala divās pamata grupās: grampozitīvās un gramnegatīvās. Nosaukums cēlies no tās izgudrotāja Hansa Kristiana Grama. Metode ļauj ātri noteikt baktēriju šūnu sieniņu īpašības un tā ir viens no pirmajiem soļiem mikrobioloģiskā izolāta identifikācijā.

Princips

Grama metode balstās uz atšķirībām baktēriju šūnu sieniņu struktūrā un ķīmiskajā sastāvā. Galvenie principi:

Peptidoglikāna slāņa biezums: grampozitīvās baktērijas satur biezu peptidoglikāna (mureīna) slāni, kas spēj noturēt pirmo krāsvielu; gramnegatīvām baktērijām peptidoglikāns ir plānāks.
Mordants un kristālviolets: kristālviolets ar joda (mordanta) palīdzību veido liela izmēra kompleksus peptidoglikānā — šie kompleksi grampozitīvajās baktērijās tiek noturēti arī pēc dekolorizācijas.
Dekolorizācija: acetona vai acetona-alkohola izsmidzināšana izskalo krāsvielu no gramnegatīvajām šūnām, jo to ārējā membrāna un plānais peptidoglikāna slānis neļauj kompleksiem to noturēt.
Kontrastkrāsa: pēc dekolorizācijas tiek uzklāta pretkrāsviela (parasti safranīns vai fuksīns), kas iekrāso gramnegatīvās šūnas rozā vai sarkanā krāsā, kamēr grampozitīvās paliek violets.

Metode — soli pa solim

Raksturīgs Grama krāsojuma protokols (laiki aptuveni; laboratorijas var izmantot nedaudz atšķirīgus nosacījumus):

1) Sagatavo siltu, izžāvētu bakteriju pastu uz stikla preparāta.
2) Uzklāj Kristālvioletu (crystal violet) — parasti 30–60 sekundes, pēc tam noskalo ar ūdeni.
3) Uzklāj joda (lugola) šķīdumu kā mordantu — 30–60 sekundes; jods stabilizē kristālvioleta kompleksu.
4) Dekolorizē ar acetonu vai acetona–alkoholu — ļoti īsi (parasti 5–30 sekundes), līdz šķidrums atgriežas caurspīdīgs; pārlieku ilga dekolorizācija var mainīt rezultātus.
5) Nekavējoties noskalo ar ūdeni un uzklāj safranīnu vai fuksīnu kā pretkrāsu — 30–60 sekundes, pēc tam noskalo un ļauj nožūt.

Novērtējums: grampozitīvās šūnas ir violeta/zelta violeta, gramnegatīvās — rozā/sarkanas.

Klasifikācija un klīniskā nozīme

Grama krāsojums palīdz ne tikai morfoloģiskā identificēšanā (kokai — apaļas, bacili — stieņveida), bet arī sniedz klīnisku ieskatu par iespējamo ārstēšanu. Piemēram:

Grampozitīvās baktērijas (piem., Staphylococcus, Streptococcus) parasti reaģē uz konkrētām antibiotiku grupām, un tām raksturīgas teichoīnskābes šūnu sieniņā.
Gramnegatīvās baktērijas (piem., Escherichia coli, Pseudomonas) satur ārējo membrānu ar lipopolisaharīdiem (LPS), kas bieži palielina izturību pret noteiktām antibiotikām un antiseptiskiem līdzekļiem.

Ātrā atšķiršana pēc Grama palīdz laboratorijām un ārstiem pieņemt lēmumus par empīriskās terapijas izvēli līdz pat pilnīgai mikrobioloģiskai identifikācijai un jutības testiem.

Izņēmumi un ierobežojumi

Gram-mainīgas vai Gram-neidentificējamas baktērijas: dažas sugas neuzrāda skaidru Grama reakciju vai reaģē netipiski. Iemesli: novecojušas kultūras, bojātas šūnas, antibiotiku ietekme vai specifiska šūnu sienas uzbūve.
Organismi bez vai ar īpašu sienu: Mycobacterium sugas (piem., tuberkuloze) satur vasks līdzīgas mykolskābes — tās parasti prasa acid-fast (Ziehl–Neelsen) krāsojumu; Mycoplasma nav šūnu sienas, tādēļ Grama metode nav lietderīga; spirālveida baktērijas (Treponema) ir ļoti tievs un var nebūt redzams standarta Grama krāsojumā.
Tehniskas kļūdas: pārlieku ilga dekolorizācija vai nepareizs mordants var izraisīt nepareizu klasifikāciju.

Vēsture

Grams izstrādāja šo metodi, strādājot kopā ar citu zinātnieku Karlu Frīdlenderu (Carl Friedländer) Berlīnes slimnīcā. Tomēr Grams pirmo reizi izmantoja šo testu, lai padarītu vieglāk pamanāmas baktērijas plaušās. Savu pabeigto metodi viņš publicēja 1884. gadā.

Praktiski padomi laboratorijā

Izpildiet protokolu konsekventi; uzmanīga dekolorizācija ir kritiska.
Vienmēr kontrolējiet krāsojumu ar zināmu grampozitīvu un gramnegatīvu kontrolkultūru.
Atcerieties, ka Grama krāsojums ir diagnostisks rīks, nevis galīga identifikācija — tā jāpapildina ar kultivēšanu, biochemiskajiem testiem vai molekulārajām metodēm.

Grama krāsošana joprojām ir viena no visplašāk izmantotajām, ātrākajām un informatīvajām metodēm mikrobioloģiskajā diagnostikā, taču to jāinterprete rūpīgi, ņemot vērā iespējamos izņēmumus un tehniskos ierobežojumus.

Grama krāsojums, kurā ir sajaukti grampozitīvi Staphylococcus aureus kokli (violetā krāsā) un Escherichia coli gramnegatīvi baciļi (sarkanā krāsā).

Jautājumi un atbildes

J: Kas ir Grama krāsošana?

A: Grama krāsošana ir metode, ar kuras palīdzību baktērijas iedala divās lielās grupās: grampozitīvās un gramnegatīvās.

J: Kas izgudroja Grama krāsošanu?

A: Grama krāsošanu izgudroja Hanss Kristiāns Grams.

J: Kā darbojas Grama krāsošana?

A: Grams iekrāso baktērijas pēc to šūnu sieniņu ķīmiskajām un fizikālajām īpašībām. Uz baktērijas uzklāj violetu krāsu, kas iekrāso peptidoglikānu, biezu slāni, kas ir tikai grampozitīvās baktērijās. Pēc pirmā krāsojuma vēl viens krāsojums (parasti safranīns vai fuksīns) visām gramnegatīvajām baktērijām piešķir sarkanu vai rozā krāsu.

J: Kāpēc ir svarīgs Grama krāsojums?

A: Grama krāsojums ir svarīgs, jo tas gandrīz vienmēr ir pirmais solis baktēriju organisma identificēšanā.

J: Vai visas baktērijas var klasificēt pēc Grama krāsojuma?

A: Nē, ne visas baktērijas var klasificēt, izmantojot Grama krāsojumu. Baktērijas, kurām šī metode nedarbojas, sauc par "Grama mainīgajām" vai "Grama nenoteiktajām" baktērijām.

J: Kam sākotnēji Grams izmantoja Grama krāsojumu?

A: Grams izmantoja Grama krāsojumu, lai padarītu vieglāk pamanāmas baktērijas plaušās.

J: Kad tika publicēta Grama krāsošanas metode?

A: Grama traipošanas metodi Grams publicēja 1884. gadā.