Cinka pirkstu nukleāzes (ZFN): ģenoma rediģēšana un DNS mērķēšana

Cinka pirkstu nukleāzes (ZFN): precīza ģenoma rediģēšana un DNS mērķēšana — jaudīga tehnoloģija gēnu modificēšanai, pētījumiem un potenciālām terapijām.

Cinka pirkstu nukleāzes (jeb ZFN) ir instruments, ko izmanto, lai mērķētu uz gēniem un mainītu DNS. Tā ir viena no trim metodēm, kā mainīt genomu, izmantojot inženierijas nukleāzes.

Tām ir divas daļas. Cinka pirkstiņi ir cilvēka radītas molekulas, kas sastāv no proteīna un cinka. Katrs no tiem saistās ar noteiktu DNS. Cinka pirkstu nukleāzes (ZFN) ir enzīmi, kas iegūti, cinka pirkstu savienojot ar DNS šķelšanas fermentu, ko sauc par Fokl. Tādējādi ZFN piesaistās konkrētai DNS sekvencei un pēc tam to nogriež divās vietās. Parastie šūnu fermenti salīmē galus kopā, atņemot izgriezto daļu (DNS labošana).

Katrs ZFN ir izgatavots tā, lai to varētu izmantot vienam gēnam, ko sauc par "mērķa gēnu" vai "mērķa DNS". Tos var izstrādāt tā, lai tie darbotos uz konkrētām gēnu daļām, radot vēlamās izmaiņas. Divi DNS izmaiņu veidi ir mutācijas, piemēram, svītrojumi un iestarpinājumi. Ģenētikas pētījumos aplūko mutējušus dzīvnieku īpatņus, lai noskaidrotu, ko konkrētais gēns dara.

Kā ZFN darbojas — īss tehniskais skaidrojums

ZFN sastāv no divām funkcionālām daļām: DNS atpazīšanas domēna (cinka pirkstiņiem) un katalītiskā domēna (parasti FokI nukleāzes domēns). Cinka pirkstiņi veido vairākus atkārtotus motīvus, no kuriem katrs parasti atpazīst 3 nukleotīdus. Lai iegūtu augstu specifiskumu, uz vienas DNS puses parasti izvieto vairākus cinka pirkstiņus (piemēram, 3–6), tāpēc kopējā atpazīstamā secība var būt 9–18 bāzes garumā.

FokI nukleāze darbojas kā dimērs — nepieciešami divi ZFN monomēri, kas piesaistās pretējām DNS saitēm ar noteiktu atstarpes (spacer) garumu starp tiem (parasti 5–7 bāzes), lai FokI domēni varētu dimerizēties un izraisīt dubultsaites lūzumu (double-strand break, DSB). Šis mērķētais lūzums aktivizē šūnas savu DNS labošanas ceļu darbību.

DNS labošanas ceļi un rezultāti

Pēc dubultsaites lūzuma šūna to labo galvenokārt divos veidos:

• Neatvietojamā savienošana (NHEJ) — ātrs, bet kļūdains process, kas bieži rada nelielas svītrošanas vai iestarpinājumu. NHEJ izmanto dzīvnieku pētījumos, lai radītu mutācijas vai "izslēgtu" gēnu (gene knockout).
• Homoloģā rekombinācija (HDR) — precīzāks labošanas ceļš, kurā var izmantot donora DNS šablonu, lai panāktu konkrētas visas secības nomaiņu vai iestarpināšanu. HDR notiek pie šūnām un apstākļiem, kuros šis ceļš ir aktīvāks, un parasti ir retāks nekā NHEJ.

Dizaina un specifiskuma jautājumi

ZFN dizains ir tehniski izaicinošs, jo cinka pirkstu proteīnu DNS saistīšanās ir jutīga pret apkārtējo nukleotīdu kontekstu. Lai samazinātu off‑target iedarbību (nejaušas saistīšanās citās genomā), tiek izmantotas vairākas stratēģijas:

• izveidot ZFN ar vairāk cinka pirkstiem, kas palielina atpazīstamo secību garumu;
• inženierēt FokI domēnu tā, lai veidotos obligāti heterodimēri (samazina homodimēru veidošanos un tādējādi kļūdainu šķelšanu);
• veikt empīrisku testēšanu un optimizāciju, tostarp mērīt potenciālās off‑target vietas atbilstoši genomam.

Lietojumi

ZFN ir izmantotas daudzos pētījumos un medicīnas priekšlikumos, piemēram:

• gēnu funkcijas noskaidrošana ģenētikas pētījumos — radot ģenētiskos modeļus;
• mērķtiecīga gēnu inaktivācija vai labošanas pētījumi šūnu līmeņa eksperimentiem;
• klīniskie pētījumi ar izmaiņām eksvivo rediģētās imūnšūnās (piemēram, izslēdzot receptorus vai modifikācijas, kas var būt noderīgas terapijās);
• lauksaimniecības biotehnoloģija — ģenētiska pielāgošana kultūrām un dzīvniekiem (pētījumos).

Praktiskie aspekti — piegāde un izmantošana

ZFN var ievadīt šūnās dažādos veidos: kā DNS (plazmīdas), kā mRNS, vai kā tieši piegādātu proteīnu; bieži izmanto arī vektorus (piem., adenovīrus, lentivīrus) vai liposomu/elektroporācijas metodes. Izvēle atkarīga no mērķa šūnu tipa, rediģējuma veida (pagaidu vai ilgstošs ekspresija) un drošības apsvērumiem.

Ierobežojumi, drošība un salīdzinājums ar citām metodēm

Galvenie ZFN ierobežojumi ir sarežģīta dizaina un inženierijas prasība, potenciālas off‑target aktivitātes un grūtības veikt vienlaicīgu daudzvietu rediģēšanu (multiplexing). Salīdzinot ar citiem mūsdienu rīkiem, piemēram, TALEN vai CRISPR–Cas sistēmu, CRISPR parasti ir vienkāršāk programmējams un lētāks plaši pielietojumā, taču ZFN joprojām ir vērtīgs, jo var piedāvāt augstu specifiskumu pie rūpīgas dizaina optimizācijas un spēju strādāt šūnu veidos vai apstākļos, kur CRISPR var nebūt ideāls.

Drošība un ētika ir svarīgi aspekti: jebkāda ģenoma rediģēšana, īpaši klīniskā vidē vai reproduktīvajā kontekstā, prasa rūpīgu risku novērtējumu, regulatīvu pārbaudi un ētisku apsvēršanu.

Kopsavilkums

ZFN ir spēcīgs un vērtīgs rīks mērķtiecīgai DNS šķelšanai un genoma modifikācijām. Lai gan dizains un izstrāde prasa vairāk laika un ekspertīzes salīdzinājumā ar dažām jaunākām teknoloģijām, ZFN nodrošina precīzu veidu, kā izraisīt dubultsaites lūzumus konkrētās genomiskajās vietās, un joprojām tiek izmantotas gan pamatpētījumos, gan klīniskā izpētē. Pareiza izvēle starp ZFN, TALEN un CRISPR atkarīga no konkrētā pētījuma mērķiem, nepieciešamā specifiskuma un pieejamajiem resursiem.

Jautājumi un atbildes

J: Kas ir cinka pirkstu nukleāzes jeb ZFN?

J: Kādas ir trīs metodes genoma maiņai ar inženierijas nukleāzēm?

J: Kas ir cinka pirkstiņi?

J: Kas ir cinka pirkstu nukleāzes (ZFN)?

J: Kas notiek, kad ZFN saistās ar konkrētu DNS sekvenci?

J: Ko dara parastie šūnu fermenti pēc tam, kad DNS ir nogriezta?

Kādi ir divi DNS izmaiņu veidi, ko var veikt cinka pirkstu nukleāzes jeb ZFN?

Meklēt pēc burta